基于細(xì)胞的ELISA技術(shù)不僅簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程

   盡管體外生物化學(xué)激酶分析(如典型的三明治ELISA)常用于假說(shuō)檢驗(yàn)和藥物篩選，但它們無(wú)法復(fù)制細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境。分析完整細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化也許能更準(zhǔn)確地代表特定信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)。一些免疫分析最近被開(kāi)發(fā)出來(lái)，能夠在完整細(xì)胞的背景下測(cè)定蛋白磷酸化。細(xì)胞在同一個(gè)孔中被刺激、固定和阻斷。使用磷酸化特異抗體，利用熒光或顯色檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)評(píng)估磷酸化狀態(tài)。此外，在微孔板的同一個(gè)孔中同時(shí)檢測(cè)磷酸化蛋白和總蛋白。因此，來(lái)自目的蛋白的信號(hào)可通過(guò)第二種蛋白來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，校正各孔之間的差異，實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白水平的準(zhǔn)確評(píng)估，并比較多個(gè)樣品，與傳統(tǒng)免疫印跡中使用磷酸化特異和總蛋白抗體相似。這些分析繞過(guò)了制備細(xì)胞裂解液的需要，因此更適合高通量分析?；诩?xì)胞的ELISA技術(shù)不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，還為信號(hào)通路研究提供了更接近生理狀態(tài)的數(shù)據(jù)。這種方法的創(chuàng)新之處在于，它巧妙地將細(xì)胞刺激、固定與檢測(cè)整合在同一個(gè)微孔中，**限度地保留了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和相互作用網(wǎng)絡(luò)。  

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)胞的固定尤為關(guān)鍵，既要確保磷酸化位點(diǎn)的充分暴露，又要避免過(guò)度交聯(lián)導(dǎo)致抗體無(wú)法識(shí)別表位。研究人員發(fā)現(xiàn)，溫和的多聚甲醛固定結(jié)合透膜處理，能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的同時(shí)，允許抗體高效結(jié)合目標(biāo)蛋白。此外，阻斷步驟的優(yōu)化也顯著降低了背景信號(hào)——使用含5%BSA和0.1%Tween-20的緩沖液，能有效減少非特異性結(jié)合，提高信噪比。  

在數(shù)據(jù)分析方面，雙抗體檢測(cè)系統(tǒng)（磷酸化抗體與總蛋白抗體）的同步應(yīng)用，使得結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化更為精準(zhǔn)。通過(guò)計(jì)算磷酸化信號(hào)與總蛋白信號(hào)的比值，可以消除細(xì)胞數(shù)量差異、孔間加樣誤差等變量干擾。這種內(nèi)參校正方式，尤其適用于藥物梯度實(shí)驗(yàn)或時(shí)間序列研究，例如觀察激酶抑制劑在不同濃度下對(duì)信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)影響。